Détermination de la Spectinomycine par Chromatographie Liquide Haute Performance Wayeal avec Détecteur ELSD

Le détecteur à diffusion de lumière par évaporation (ELSD) est un nouveau détecteur de masse avec une applicabilité théorique à tout composé capable de former des particules gazeuses. L'édition 2025 de la Pharmacopée spécifie l'utilisation de la détection par diffusion de lumière par évaporation (ELSD) pour l'analyse et le contrôle qualité de plus de 100 variétés de médicaments. En pratique, l'ELSD est plus fréquemment appliqué aux composés dépourvus d'absorption ultraviolette (UV), tels que l'astragaloside, les glucides, les aminosides et le cholestérol, servant souvent de méthode de détection complémentaire aux détecteurs UV et à fluorescence. Cependant, les résultats de l'ELSD sont influencés par de multiples facteurs, notamment la composition de la phase mobile, la concentration de solvant organique, le mode d'élution et les conditions de nébulisation. Par conséquent, pour garantir des résultats analytiques précis et cohérents, il est essentiel d'évaluer l'impact de ces facteurs sur les résultats.
Cette étude, faisant référence à la méthode analytique pour le chlorhydrate de spectinomycine de la partie II de la Pharmacopée 2025 et guidée par les principes ICH QbD, a utilisé une conception expérimentale orthogonale pour cribler et optimiser les conditions analytiques.

Fig 1 Chlorhydrate de spectinomycine

2. Instrument et méthode

Dans cette étude, l'analyse chromatographique a été réalisée à l'aide du système HPLC série LC3200 de Wayeal. La configuration de l'instrument comprenait une pompe à gradient quaternaire, un passeur automatique, un compartiment à colonne et un détecteur à diffusion de lumière par évaporation. Le contrôle du système et l'acquisition/traitement des données ont été effectués avec le logiciel de chromatographie SmartLab 2.0.

Tableau 1 Conditions HPLC

3. Préparation de la solution

Solution d'échantillon : La solution mère de chlorhydrate de spectinomycine a été fournie par le client avec une concentration étiquetée de 10 mg/mL et une pureté de 99,8 %.

Solution aqueuse d'acide trifluoroacétique à 0,1 M :Prélever avec précision 6,8 mL d'acide trifluoroacétique dans une fiole jaugée de 1 000 mL. Diluer jusqu'au trait avec de l'eau purifiée et bien mélanger. Enfin, filtrer sous vide la solution à travers un filtre à membrane en cellulose de 0,45 µm avant utilisation.

Solutions étalons : La solution mère a été diluée avec de l'eau purifiée pour préparer des solutions d'échantillon avec des concentrations de 0,15, 0,25, 0,35, 0,50 et 0,70 mg/mL, respectivement. Chaque solution a ensuite été filtrée à travers un filtre à membrane en cellulose de 0,45 µm avant utilisation.

4. Résultats et discussion

La Pharmacopée chinoise utilise des conditions chromatographiques identiques pour l'analyse des substances apparentées et de la teneur en composant principal dans l'entrée du chlorhydrate de spectinomycine. La méthode stipule que « le détecteur peut être configuré en fonction des circonstances réelles ». Au cours de l'étude, compte tenu des caractéristiques instrumentales de l'ELSD3260, des exigences de la méthode analytique et de la littérature pertinente, une conception expérimentale de Plackett-Burman a été utilisée pour cribler plusieurs paramètres expérimentaux (tableaux 2 et 3). Par la suite, une conception de Box-Behnken (tableau 4) a été utilisée pour optimiser la réponse de l'aire du pic du détecteur ELSD.

Tableau 2 Conception expérimentale de Plackett-Burman

Tableau 3 Analyse ANOVA des résultats expérimentaux de Plackett-Burman

Comme on peut le voir dans le tableau 3, le débit de gaz, le débit de la phase mobile et la compensation post-colonne ont montré des effets négatifs. Plus précisément, la réduction du débit de gaz et du débit de la phase mobile, ainsi que la désactivation de la compensation post-colonne, pourraient augmenter la réponse du pic chromatographique. Cependant, la diminution du débit de la phase mobile peut entraîner un élargissement accru des pics et une sensibilité de détection réduite. Par conséquent, le débit a été maintenu constant avec la méthode standard. Bien que la température de la colonne et la température de détection aient présenté des effets positifs, elles n'ont pas amélioré de manière significative la valeur de la réponse. Par conséquent, les études ultérieures se concentreront sur l'optimisation du débit de gaz, de la température du nébuliseur et de la température de l'évaporateur.

Les effets du débit de gaz, de la température du nébuliseur et de la température de l'évaporateur sur la valeur de la réponse ont été étudiés en utilisant une conception expérimentale de Box-Behnken dans le cadre d'une méthodologie de surface de réponse. La conception expérimentale est présentée dans le tableau 4.

Tableau 4 Conception expérimentale de Box-Behnken

Les conditions de détection du chlorhydrate de spectinomycine ont été déterminées en simulant la variation de l'aire du pic à l'aide de la méthodologie de surface de réponse (figure 2) et en tenant compte des plages de paramètres instrumentaux : température du nébuliseur 85 °C, température de l'évaporateur 80 °C, température du détecteur 50 °C et débit de gaz 0,2 SLM.

A. Effet du débit de gaz et de la température de l'évaporateur sur l'aire du pic

B. Effet du débit de gaz et de la température du nébuliseur sur l'aire du pic

C. Effet de la température du nébuliseur et de la température de l'évaporateur sur l'aire du pic

Fig 2 Variation de l'aire du pic

Précision d'injection

La solution mère de chlorhydrate de spectinomycine a été diluée à 0,35 mg/mL, et six injections consécutives ont été effectuées dans les conditions chromatographiques spécifiées avec enregistrement des chromatogrammes. Les écarts types relatifs (RSD %) du temps de rétention et de l'aire du pic pour le pic chromatographique du chlorhydrate de spectinomycine ont été calculés. Les résultats sont présentés dans le tableau 5.

Tableau 5 Résultats du test de précision d'injection

Spécificité

Selon la directive ICH Q2(R2) sur la validation des procédures analytiques et le chapitre général de la Pharmacopée chinoise 〈9101〉 Lignes directrices sur la validation des méthodes analytiques, la méthode optimisée a été validée pour la spécificité, la gamme linéaire, la précision et la répétabilité.

De l'eau purifiée et la solution d'échantillon (0,35 mg/mL) ont été analysées en parallèle avec enregistrement des chromatogrammes. Les résultats (figure 3) n'ont montré aucun pic chromatographique au temps de rétention du chlorhydrate de spectinomycine dans le chromatogramme de l'eau purifiée, tandis que le pic du chlorhydrate de spectinomycine dans la solution d'échantillon a obtenu une séparation de base des pics adjacents (R > 1,5).

Fig 3 Résultats analytiques de l'échantillon de chlorhydrate de spectinomycine (0,35 mg/mL)

Gamme linéaire

Préparer trois échantillons parallèles de solution mère de chlorhydrate de spectinomycine selon la méthode de préparation de la solution standard, les analyser dans des conditions chromatographiques et enregistrer les chromatogrammes. Effectuer une analyse de régression en utilisant les aires des pics chromatographiques et les concentrations correspondantes.

Fig 4 Résultats du test de linéarité (transformés par logarithme par rapport à non transformés)

Selon la littérature, la relation entre la valeur de réponse ELSD et la concentration est non linéaire, ce qui nécessite une transformation logarithmique de la valeur de réponse et de la concentration avant d'effectuer une analyse de régression [8,9,10]. Après avoir appliqué une transformation logarithmique aux données expérimentales, le coefficient de corrélation de la courbe de régression linéaire a dépassé 0,999, ce qui est significativement meilleur que le résultat obtenu sans transformation logarithmique (comme le montre la figure 4).

Précision et répétabilité

La solution mère de chlorhydrate de spectinomycine a été diluée à des concentrations de 0,25, 0,35 et 0,50 mg/mL. Pour chaque concentration, trois échantillons parallèles ont été préparés, analysés dans les conditions chromatographiques spécifiées et les chromatogrammes ont été enregistrés. La teneur a été calculée à l'aide de la courbe de régression, et la récupération et la répétabilité ont été évaluées. Les résultats sont présentés dans le tableau 6.

Tableau 6 Résultats du test de récupération

Limite de quantification (LOQ)

Diluer la solution mère de chlorhydrate de streptomycine à une concentration de 12 µg/mL. Analyser l'échantillon dans des conditions chromatographiques et enregistrer le chromatogramme. Calculer le rapport signal/bruit (S/N) du pic chromatographique du chlorhydrate de streptomycine et déterminer sa répétabilité. Les résultats sont présentés dans le tableau 7.

Tableau 7 Résultat du test LOQ

Les résultats indiquent que, selon l'exigence de la directive ICH de S/N > 10, l'écart type relatif de l'aire du pic pour cette concentration de solution de chlorhydrate de spectinomycine satisfait aux critères. Par conséquent, il peut servir de norme de limite quantitative pour le chlorhydrate de spectinomycine.

5. Conclusion

Sur la base de la méthode de la pharmacopée, cette étude a établi une procédure analytique fiable et robuste pour la quantification du chlorhydrate de spectinomycine. Les conditions du détecteur à diffusion de lumière par évaporation (ELSD) ont été systématiquement optimisées. La méthode optimisée a démontré une stabilité et une précision améliorées, une sensibilité de détection plus élevée et une gamme linéaire satisfaisante.

Le détecteur ELSD3260 est un détecteur à flux divisé à basse température nouvellement conçu et développé. Il convient à l'analyse des substances non volatiles et semi-volatiles, offrant une alternative précieuse pour les composés dépourvus d'absorption UV. Dans cette étude, l'utilisation de l'ELSD3260 pour l'analyse du chlorhydrate de spectinomycine a donné d'excellentes valeurs de réponse et une bonne reproductibilité, ainsi qu'une sensibilité de détection accrue. Ces résultats démontrent que cet instrument est bien adapté à l'analyse quantitative du chlorhydrate de spectinomycine.