Détermination des résidus d'érythromycine dans les résidus de fermentation antibiotique à l'aide du système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse Wayeal LCMS-TQ9200

L'érythromycine est un antibiotique macrolide produit par la fermentation de Streptomyces erythreus. Elle exerce son effet antibactérien principalement en inhibant la synthèse des protéines bactériennes. La production d'érythromycine repose principalement sur la technologie de bio-fermentation, impliquant des étapes telles que la sélection de la souche, la culture de la semence, la fermentation à grande échelle dans des cuves, l'extraction et la purification. Après la fermentation, l'érythromycine est extraite avec des solvants organiques (tels que l'acétate de butyle), suivie d'une purification par cristallisation ou séparation sur résine échangeuse d'ions, ce qui donne finalement des sels de qualité clinique (par exemple, l'éthylsuccinate d'érythromycine). Cependant, le processus de production d'érythromycine génère une quantité importante de résidus mycéliens (résidus de fermentation), qui peuvent contenir des antibiotiques résiduels, des protéines microbiennes et des sous-produits métaboliques. S'ils ne sont pas gérés correctement, ces résidus peuvent entrer dans la chaîne écologique par le biais des rejets environnementaux ou de l'utilisation comme additifs pour l'alimentation animale, entraînant de multiples dangers : l'érythromycine résiduelle peut favoriser la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques dans les sols et les masses d'eau, perturbant l'équilibre des communautés microbiennes ; amplifiée par la chaîne alimentaire, elle peut induire l'émergence de souches bactériennes résistantes chez les animaux ou les humains, compromettant l'efficacité des antibiotiques ; de plus, la matière organique sous-utilisée dans les résidus peut provoquer une pollution environnementale. Par conséquent, une réglementation stricte des résidus mycéliens est une mesure essentielle pour contrôler la pollution issue de la production d'érythromycine.

Cette expérience a été menée en référence à la norme "T/PIAC 00003—2021 Norme de groupe de la China Pharmaceutical Industry Association - Méthode de détermination de l'érythromycine dans les résidus d'antibiotiques, les matières de base des engrais organiques, les cultures et les milieux environnementaux", en utilisant le système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse Wayeal LCMS-TQ9200 pour déterminer la teneur en érythromycine dans les résidus mycéliens. Les résultats expérimentaux indiquent que le test d'aptitude du système a démontré une bonne forme de pic et une bonne linéarité, répondant aux exigences expérimentales.

1. Instruments et réactifs

1.1 Liste de configuration du LCMS

Tableau 1 Liste de configuration des instruments

1.2 Réactifs et étalons

Tableau 2 Liste des réactifs et des étalons

1.3 Matériel expérimental et équipement auxiliaire

Nettoyeur à ultrasons

Mélangeur vortex

Centrifugeuse à grande vitesse

2. Méthode expérimentale

2.1 Prétraitement de l'échantillon

Peser 0,5 g de l'échantillon (précision à 0,001 g) dans un tube à essai à bouchon de verre. Ajouter 50 ml d'acétonitrile, vortexer pendant 1 minute pour homogénéiser le mélange et effectuer une extraction assistée par ultrasons pendant 20 minutes. Transférer ensuite le mélange dans un tube à centrifuger de 50 ml et centrifuger à 4000 tr/min pendant 10 minutes. Recueillir une quantité appropriée du surnageant et le faire passer à travers une membrane filtrante de 0,22 μm. Jeter au moins 1 ml du filtrat initial, puis transférer le reste du filtrat dans une fiole LC ambrée pour l'analyse.

2.2 Conditions expérimentales

2.2.1 Conditions de la méthode de chromatographie liquide

Colonne de chromatographie : C18 1,7 μm 2,1x50mm

Phase mobile : A : Acétonitrile, B : Acide formique à 0,1 % dans l'eau

Débit : 0,3 ml/min

Température de la colonne : 30℃

Volume d'injection : 2 μL

2.2.2 Conditions de la méthode de spectrométrie de masse

Tableau 3 Paramètres de la source d'ions de spectrométrie de masse

3. Résultat de l'expérience

3.1 Test d'aptitude du système

Les résultats du test d'aptitude du système ont montré des pics cibles bien définis sans interférence de pics étrangers, répondant à toutes les exigences expérimentales.

Fig 1 Chromatogramme de la solution de travail standard d'érythromycine A (0,5 ng/ml)

3.2 Gamme linéaire

La courbe d'étalonnage pour l'érythromycine A a été préparée en diluant en série la solution standard en utilisant des solutions de travail à concentration intermédiaire. La courbe a démontré une excellente linéarité sur la plage de 0,5 à 500 ng/ml, avec un coefficient de corrélation (R²) supérieur à 0,99.

Tableau 4 Gamme linéaire de l'érythromycine A

Fig 2 Courbe d'étalonnage pour l'érythromycine A

3.3 Limite de détection (LOD) et limite de quantification (LOQ)

Dans cette méthode, la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) pour la solution standard d'érythromycine A ont été déterminées à 0,2 ng/ml et 0,5 ng/ml, respectivement. Les rapports signal/bruit (S/N) correspondants étaient de 110,02 et 292,20, dépassant substantiellement les exigences minimales de 3 et 10, remplissant ainsi les critères de sensibilité expérimentale.

Figure 3. Chromatogrammes d'ions extraits pour la LOD et la LOQ de l'érythromycine A

3.4 Test de précision

La solution d'érythromycine A a été injectée consécutivement sept fois, les résultats étant présentés dans la figure ci-dessous. L'écart du temps de rétention pour l'érythromycine A était de 0,19 %, et l'écart de l'aire du pic était de 0,96 %, tous deux inférieurs à 5 %, répondant aux exigences expérimentales.

Figure 4. Chromatogrammes de précision de l'échantillon d'érythromycine A (7 injections)

3.5 Test de l'échantillon

Suite à la méthode de prétraitement susmentionnée, l'aire du pic cible dans l'échantillon solide était de 7,4E6. Calculée via la méthode de l'étalon externe, la teneur en érythromycine A dans la solution d'échantillon a été déterminée à 400 ng/ml.

Fig 5 Chromatogramme du test de l'échantillon d'érythromycine A

4. Conclusion

Cette méthode utilise le système de chromatographie liquide-spectrométrie de masse Wayeal LCMS-TQ9200 pour la détermination de la teneur en érythromycine A dans les résidus de fermentation d'antibiotiques. Les données indiquent que la méthode démontre d'excellentes performances : tous les pics chromatographiques présentent une forme optimale sans traînée, et la sensibilité répond aux exigences expérimentales. Le coefficient de corrélation linéaire (R²) dépasse 0,99. Les écarts du temps de rétention et de l'aire du pic pour tous les composés sur sept injections consécutives sont inférieurs à 1 %, ce qui indique une grande précision. Les chromatogrammes des échantillons ne montrent aucune interférence de pics étrangers, et la teneur mesurée de l'échantillon est de 400 ng/ml. Cette méthode, équipée du système Wayeal LC-MS/MS, répond aux exigences pour l'analyse qualitative et quantitative de routine des échantillons testés.