Détermination des résidus d'antibiotiques phénicolés dans la viande de poulet par LCMS-TQ9200 Wayeal

Mots-clés : LCMS, amphénicol, sécurité alimentaire, résidus de médicaments vétérinaires.

1. Instruments et réactifs

1.1 Liste de configuration du LCMS

Tableau 1 Liste de configuration des instruments

1.3 Matériels expérimentaux et équipements auxiliaires

Nettoyeur à ultrasons

Mélangeur vortex

Évaporateur d'azote au bain-marie

Centrifugeuse à grande vitesse

2. Méthodes expérimentales

2.1 Préparation de la solution

2.1.1 Solution d'acétate d'éthyle ammoniacal à 2 % : Prélever 4 mL d'eau ammoniacale et diluer à 200 mL avec de l'acétate d'éthyle.

2.1.2 Solution de chlorure de sodium à 4 % : Prélever 4 g de chlorure de sodium, dissoudre dans de l'eau et diluer à 100 mL.

2.1.3 Solution de n-hexane saturée de chlorure de sodium à 4 % : Prélever une quantité appropriée de solution de chlorure de sodium à 4 %, ajouter un excès de n-hexane, mélanger, laisser reposer pour la séparation des couches et prélever la couche supérieure de n-hexane.

2.1.4 Solution de travail d'étalon interne mixte : Prélever une quantité appropriée de la solution mère d'étalon interne mixte, diluer avec du méthanol à 20 % pour obtenir du chloramphénicol-D5 à 10 ng/mL et d'autres étalons internes (florfénicol-D3, thiophénicol-D3 et amine de florfénicol-D3) à 50 ng/mL chacun.

2.2 Prétraitement de l'échantillon

2.2.1 Extraction de l'échantillon : Peser 2 g d'échantillon (précision de ±0,01 g), ajouter 100 µL de solution de travail d'étalon interne mixte, vortexer pendant 1 min, ajouter 10 mL de solution d'acétate d'éthyle ammoniacal à 2 %, vortexer pendant 10 min, centrifuger à 8 000 tr/min pendant 5 min et recueillir le surnageant. Ajouter encore 10 mL de solution d'acétate d'éthyle ammoniacal à 2 % au résidu et répéter la procédure d'extraction. Combiner les deux surnageants, évaporer à sec sous un courant d'azote à 50 °C et réserver pour utilisation.

2.2.2 Purification de l'échantillon : Ajouter 3 mL de solution de chlorure de sodium à 4 % au résidu de purification, vortexer pour dissoudre, puis ajouter 5 mL de solution de n-hexane saturée de chlorure de sodium à 4 %, vortexer pendant 30 s, centrifuger à 8 000 tr/min pendant 5 min et jeter la couche supérieure de n-hexane. Répéter la procédure de dégraissage une fois. Ajouter 5 mL de solution d'acétate d'éthyle ammoniacal à 2 %, vortexer pendant 10 min, centrifuger à 8 000 tr/min pendant 5 min et recueillir le surnageant. Ajouter encore 5 mL de solution d'acétate d'éthyle ammoniacal à 2 % au résidu et répéter la procédure d'extraction. Combiner les surnageants, évaporer à sec sous un courant d'azote à 50 °C, ajouter 1 mL de solution de méthanol à 20 %, vortexer pendant 30 s, filtrer à travers une membrane et attendre l'analyse instrumentale.

2.3 Conditions expérimentales

2.3.1 Conditions de chromatographie liquide

Colonne de chromatographie : C18 1,7 µm 2,1x50 mm

Phase mobile : A : Acétonitrile ; B : Formiate d'ammonium 2 mM dans l'eau

Débit : 0,3 mL/min

Température de la colonne : 40 °C

Volume d'injection : 5 µL

2.3.2 Conditions de spectrométrie de masse

Tableau 3 Paramètres de la source d'ions

3. Résultat de l'expérience

3.1 Chromatogramme standard

La détermination de quatre antibiotiques amide et de leurs étalons internes a été effectuée en moins de 6 minutes. Tous les pics ont montré de bonnes formes de pic sans traînage, et chaque composé a démontré une réponse satisfaisante, répondant aux exigences expérimentales.

Fig. 1 Chromatogramme de 4 antibiotiques amphénicols et étalon interne (chloramphénicol 0,2 ng/mL, autres antibiotiques 1 ng/mL)

3.2 Plage linéaire

Prélever une quantité appropriée de la solution étalon mixte d'alcool amide et la diluer par étapes à une série de concentrations pour préparer une courbe étalon. La méthode de l'étalon interne isotopique a été utilisée pour l'analyse quantitative. La plage linéaire était de 0,2 à 10 ng/mL pour le chloramphénicol et de 1 à 50 ng/mL pour l'amine de florfénicol, le thiophénicol et le florfénicol. L'écart entre les résultats de la détection linéaire et les concentrations connues était inférieur à l'écart maximal admissible, avec des valeurs de R² allant de 0,9958 à 0,9998, ce qui indique une excellente linéarité pour tous les composants.

Tableau 4 Plage linéaire des composés

Fig. 2 Données de la courbe d'étalonnage des quatre composés

3.3 LOD et LOQ

La norme chinoise de sécurité alimentaire GB 31658.20-2022 spécifie que pour cette méthode, la limite de détection (LOD) pour le chloramphénicol est de 0,1 µg/kg et la limite de quantification (LOQ) est de 0,2 µg/kg ; tandis que pour le thiophénicol, le florfénicol et l'amine de florfénicol, la LOD est de 0,5 µg/kg et la LOQ est de 1 µg/kg. Les rapports signal/bruit pour tous les composés cibles aux concentrations spécifiées de la limite de détection (LOD) et de la limite de quantification (LOQ) sont significativement supérieurs à 3 et 10, ce qui est conforme aux exigences de sensibilité spécifiées dans la norme nationale.

Tableau 5 Limites de détection et de quantification pour chaque composé

Fig. 3 Chromatogrammes des limites de détection et des limites de quantification pour quatre composés

3.4 Test de précision

Prélever des concentrations faibles, moyennes et élevées de solutions mixtes étalons d'amphénicol et effectuer six injections consécutives pour comparer les écarts du temps de rétention et de l'aire du pic. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. Les écarts du temps de rétention de tous les composés amphénicols étaient inférieurs à 1 %, et les écarts de l'aire du pic étaient inférieurs à 5 %, ce qui répond aux exigences de précision de RSD ≤ 15 % spécifiées par la norme nationale.

Tableau 6 Test de précision pour chaque composé

Fig. 4 Chromatogrammes de précision des quatre composés d'alcool amide

3.5 Test de récupération par ajout de matrice

La précision de cette méthode de détection a été évaluée à l'aide d'un test de récupération par ajout. Ajouter des concentrations connues d'échantillons étalons à l'échantillon de matrice vierge à différents rapports pour le prétraitement, en préparant des échantillons dopés à la matrice à des concentrations élevées, moyennes et faibles. Chaque niveau de concentration des échantillons dopés a été analysé indépendamment six fois. Le taux de récupération a été calculé en comparant la concentration détectée dans la matrice avant et après le dopage, évaluant ainsi la précision de la méthode. Les résultats sont les suivants : dans la matrice de poulet, les taux de récupération par ajout de tous les composés variaient de 94,5 % à 107,2 %, avec un CV inférieur à 5 %, ce qui indique que la précision répond aux exigences de la méthode.

Tableau 6 Taux de récupération des composés dans la matrice de poulet dopée

3.6 Test d'échantillon

Des échantillons de blanc de poulet achetés au hasard dans des supermarchés ont été extraits et purifiés à l'aide de la méthode de prétraitement des échantillons susmentionnée. Après avoir testé les échantillons sur l'instrument, aucun des quatre antibiotiques amide n'a été détecté.

Fig. 5 Chromatogramme des quatre composés d'alcool amide dans les échantillons de blanc de poulet de supermarché

4. Conclusion

Cette méthode utilise le système de spectrométrie de masse par chromatographie liquide LCMS-TQ9200 de Wayeal pour la détermination des antibiotiques amphénicols dans les aliments d'origine animale, ce qui permet l'acquisition simultanée de composés en modes d'ions positifs et négatifs. Les données indiquent que la méthode fournit des pics chromatographiques bien formés sans traînage, et sa sensibilité répond aux exigences de la norme nationale. Les coefficients de corrélation linéaire sont tous supérieurs à 0,99. L'écart du temps de rétention pour tous les composés sur six injections consécutives est inférieur à 1 %, et l'écart de l'aire du pic est inférieur à 5 %, ce qui démontre une bonne précision. Les taux de récupération par ajout dans la matrice de poulet varient de 94,5 % à 107,2 %, avec un CV inférieur à 5 %, ce qui indique que la précision répond aux exigences méthodologiques. Des échantillons de blanc de poulet achetés au hasard dans des supermarchés ont été analysés, et aucun des quatre antibiotiques amphénicols n'a été détecté. Cela démontre que la méthode, équipée du système de spectrométrie de masse par chromatographie liquide de Wayeal, répond aux exigences de détection qualitative et quantitative de routine des échantillons cibles.