Détermination de l'aflatoxine B1, un cancérogène du groupe 1, dans les cultures oléagineuses par le système Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

Aflatoxine B₁est un métabolite secondaire hautement toxique produit principalement par Aspergillus flavuset Aspergillus parasiticus. Parmi la famille des aflatoxines, elle présente la plus forte toxicité et la plus large distribution. Il exerce ses effets toxiques en inhibant la synthèse intracellulaire d’ADN et d’ARN et en interférant avec le métabolisme des protéines, avec un effet néfaste très ciblé sur le foie.Comparée à d'autres mycotoxines telles que l'ochratoxine et la patuline, l'aflatoxine B₁est extrêmement toxique et possède une cancérogénicité bien établie. Il a été classé comme un Cancérogène du groupe 1par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Il est fréquemment détecté dans les cultures oléagineuses telles que les arachides, le maïs, les noix et les huiles végétales, ce qui en fait un contaminant prioritaire pour le contrôle de la sécurité alimentaire dans le monde entier.

Contamination par l'aflatoxine B₁se produit généralement lorsque les cultures oléagineuses sont exposées à des températures et une humidité élevées pendant la plantation, la récolte ou le stockage, ce qui favorise la croissance fongique. De plus, en raison de ses propriétés chimiques stables, l'aflatoxine B₁ne peuvent pas être détruits par les températures de cuisson conventionnelles, ce qui entraîne des problèmes récurrents de résidus dans les produits agricoles et les aliments transformés.

L'ingestion à court terme d'une dose élevée peut provoquer une intoxication aiguë, se manifestant par des symptômes tels que des douleurs abdominales sévères, des vomissements, une jaunisse et une insuffisance hépatique, qui peuvent être fatales dans les cas graves. Une exposition à long terme à de faibles doses entraîne une accumulation dans le foie, provoquant des lésions hépatiques chroniques telles que la fibrose hépatique et la cirrhose, et peut même déclencher un cancer primitif du foie. Les populations ayant une immunité plus faible, notamment les enfants, les personnes âgées et les personnes souffrant de maladies hépatiques préexistantes, courent un risque plus élevé de contracter l'aflatoxine B.₁empoisonnement.

En Chine, la norme nationale GB 2761-2017 (National Food Safety Standard – Maximum Levels of Mycotoxins in Foods) précise les limites maximales de résidus d'aflatoxine B.₁dans divers types d'aliments. En plus, GB 5009.22-2016 (Norme nationale de sécurité alimentaire – Détermination des aflatoxines B et G dans les aliments)fournit des méthodes d'analyse officielles pour la détermination de l'aflatoxine B₁.

Cette note d'application décrit l'établissement d'une méthode de chromatographie liquide par dilution isotopique-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour la détermination de l'aflatoxine B.₁en utilisant le système Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS.

Mots-clés :Triple quadripôle ; Aflatoxine B₁; Chromatographie liquide à dilution isotopique-spectrométrie de masse en tandem.

1. Instrument et réactifs

1.1 Configuration des instruments

Tableau 1 Liste de configuration des instruments

1.2 Réactifs et étalons

Tableau 2 Réactifs et étalons

1.3 Matériel d'expérimentation et équipement auxiliaire

Mélangeur vortex

Centrifugeuse à grande vitesse

Balance analytique

Centrifuger

Collecteur d'extraction en phase solide (SPE) (avec pompe à vide)

Évaporateur d'azote

Shaker

2. Méthode expérimentale

2.1 Préparation de la solution

2.1.1 Solution d'acétate d'ammonium à 5 mmol/L :Pesez 0,39 g d'acétate d'ammonium, dissolvez-le dans l'eau et diluez à 1 000 ml. Bien mélanger.

2.1.1 Solution méthanol-acétonitrile :Ajouter 100 ml d'acétonitrile à 100 ml de méthanol, puis bien mélanger.

2.2 Prétraitement des échantillons

2.2.1 Extraction d'échantillons

Passer la farine de blé au tamis à essai de 2 mm d'ouverture. Peser 5 g de l’échantillon (précis à 0,01 g) dans un tube à centrifuger de 50 ml. Ajouter 100µL de solution de travail étalon interne isotopique (100ng/mL), mélanger au vortex et laisser reposer 30 min. Ajouter 20 ml de solution méthanol-eau (70+30, v/v), mélanger au vortex et agiter sur un agitateur orbital pendant 20 min. Centrifuger à 6000r/min pendant 10min. Recueillir le surnageant pour une utilisation ultérieure.

2.2.2 Purification des échantillons

Transférer avec précision 4 mL du surnageant dans un récipient, ajouter 23 mL de Triton X-100 à 1 % dans du PBS et bien mélanger.

Une fois que le liquide d’origine de la colonne d’immunoaffinité s’est complètement vidé, transférez la solution échantillon ci-dessus dans une seringue de 50 ml. Ajustez le débit de manière à ce que la solution échantillon traverse la colonne de manière constante à un débit de 1 à 3 ml/min. Une fois la solution échantillon complètement drainée, ajoutez 2 × 10 ml d’eau dans le corps de la seringue et lavez la colonne d’immunoaffinité à un débit constant. Une fois l'eau évacuée, séchez la colonne à l'aide d'une pompe à vide.

Débranchez le système de vide. Placez un tube à essai gradué de 10 mL sous la colonne d’immunoaffinité, retirez le corps de la seringue de 50 mL et ajoutez 2 × 1 mL de méthanol pour éluer la colonne à un débit contrôlé de 1 à 3 mL/min. Séchez ensuite à nouveau la colonne à l'aide d'une pompe à vide. Recueillir tout l'éluat dans le tube à essai.Évaporer doucement l'éluat jusqu'à ce qu'il soit presque sec sous un courant d'azote à 50 °C. Ajouter 1 mL de la phase mobile initiale, vortexer pendant 30 secondes pour dissoudre le résidu. Filtrer à travers un filtre à membrane de 0,22 μm et recueillir le filtrat dans un flacon d’échantillonneur automatique pour une injection ultérieure.

2.3 Conditions d'expérimentation

2.3.1 Méthode de chromatographie liquide

Colonne : C18, 1.7µm, 2,1×50 millimètres

Phase mobile : A : solution méthanol-acétonitrile ; Phase B : solution d’acétate d’ammonium 5 mmol/L

Débit : 0,3 mL/min

Température de la colonne : 40°C

Volume d'injection : 3µL

2.3.2 Méthode de spectrométrie de masse

Tableau 3 Paramètres de spectrométrie de masse composée

Remarque : L'astérisque (*) indique l'ion quantitatif.

3. Résultat de l'expérience

3.1 Chromatogramme standard

La détermination de l'aflatoxine B₁et l'étalon interne isotopique 13C17-aflatoxine B₁a été terminé en 5 minutes. Comme l'illustre la figure 1, les deux analytes ont présenté d'excellentes formes de pics et des réponses satisfaisantes, répondant aux exigences de l'analyse expérimentale.

Fig 1 Chromatogrammes de l'aflatoxine B₁et l'étalon interne isotopique 13C17​-Aflatoxine B₁

3.2 Plage linéaire

Un volume approprié de la solution mère étalon et de la solution de travail étalon interne mixte d'isotopes ont été transférés avec précision et dilués avec la phase mobile initiale pour préparer une série de solutions de travail étalons contenant de l'aflatoxine B.₁concentrations de 50, 20, 10, 5, 2, 1 et 0,5ng/mL. Chaque solution contenait l’étalon interne isotopique à une concentration de 2 ng/mL. Une courbe d'étalonnage a été construite à l'aide de ces étalons. Sur la plage linéaire de 0,5–50ng/mL, et après correction par 13C 17-aflatoxine B₁comme étalon interne, les écarts entre l'aflatoxine B mesurée et nominale₁les concentrations se situaient dans la déviation maximale admissible. Le coefficient de corrélation (R) était supérieur à 0,999, indiquant une excellente linéarité.

Fig 2 Courbe standard de l'aflatoxine B₁

3.3 Répétabilité

Des solutions étalons à trois concentrations (1, 10 et 20 ng/mL) ont été injectées six fois consécutives. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous. Les écarts types relatifs (RSD) des temps de rétention et des quantités d'échantillons pour l'aflatoxine B₁aux concentrations faibles, moyennes et élevées, elles étaient toutes inférieures à 5 %, répondant ainsi aux exigences de l'expérience.

Tableau 4 Test de répétabilité pour l'aflatoxine B₁à des concentrations faibles, moyennes et élevées

3.4 Récupération des pics

Aflatoxine B₁Une solution standard a été ajoutée à l’échantillon pour atteindre une concentration finale de 5 ng/mL. L’échantillon enrichi a ensuite été analysé par LC-MS/MS. Le résultat moyen de six injections consécutives était de 5,147 ng/mL, avec un RSD de 1,954 %. Le taux de récupération calculé était de 102,94 %, ce qui répond aux exigences de l'expérience.

3.5 Résidu vierge

Après avoir injecté en continu la solution étalon à 20 ng/mL, un échantillon à blanc a ensuite été injecté pour évaluer le transfert. Comme le montre la figure 3, aucun transfert n'a été détecté dans l'échantillon à blanc.

Fig 3 Chromatogramme vierge du composé

3.6 Exemple de test

Aflatoxine B₁n'a pas été détecté dans l'échantillon A (figure 4).

Fig 4 Chromatogramme de l'aflatoxine B₁dans l'échantillon A

4. Conclusion

Dans cette étude, une méthode de chromatographie liquide par dilution isotopique et de spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) pour la détermination de l'aflatoxine B₁a été établi à l’aide du système de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide Wayeal LCMS-TQ9200. Les données obtenues démontrent que tous les pics chromatographiques présentent de bonnes formes sans traînée. La sensibilité répond aux exigences expérimentales et le coefficient de corrélation (R) est supérieur à 0,999, satisfaisant les critères de linéarité. La répétabilité aux concentrations faibles, moyennes et élevées est inférieure à 5 % et aucun transfert de système n'est observé après l'injection d'un échantillon à haute concentration. Ces résultats indiquent que la méthode, lorsqu’elle est équipée du système de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide Wayeal, répond aux exigences de l’analyse qualitative et quantitative de routine des échantillons cibles.