62/2000 Protégez la santé des nourrissons et des jeunes enfants ! La chromatographie ionique Wanyi détermine sept types de lait maternel humain

Préface

Les oligosaccharides du lait humain (OEM) sont un groupe d'oligosaccharides dont le degré de polymérisation n'excède pas 3 et qui sont présents naturellement dans le lait humain.ils sont le troisième composant solide le plus important du lait maternelIls régulent la flore intestinale, en particulier en favorisant la colonisation des Bifidobactéries dans l'intestin du nourrisson, tout en préservant la santé intestinale.soutient le développement immunitaire et cérébralDepuis le lancement des premières préparations pour nourrissons enrichies en HMO aux États-Unis en 2015,une large gamme de préparations pour nourrissons, le lait et les produits laitiers, les suppléments digestifs et les aliments fonctionnels contenant des OMS ont été vendus dans le monde entier.2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, difucosyllactose, lacto-N-néotétraose, lacto-N-tétraose, 3'-sialyllactose et 6'-sialyllactose.

Parmi les méthodes courantes de détection des OMH, la chromatographie liquide nécessite une réaction de dérivation avant la détection, implique une préparation d'échantillons complexe et les réactifs de dérivation sont souvent toxiques;La nature thermo-labile des OMS entraîne également une faible réponse et une faible répétabilité dans le LC-MS.En revanche, la chromatographie ionique avec détection ampérométrique des glucides offre une préparation d'échantillons simple, une grande réactivité et une bonne répétabilité, ce qui lui confère des avantages évidents pour l'analyse HMO.Cette note d'application utilise de l'hydroxyde de sodium préparé manuellement, l'acétate de sodium et l'eau ultrapure comme éluants, et utilise le chromatographe ionique WAYEAL IC6300 pour déterminer les OMS dans les préparations pour nourrissons.haute sensibilité et bonne linéarité, fournissant une référence utile pour la détection des OMH dans les aliments.

Mots clés: chromatographe ionique; oligosaccharides du lait humain; détecteur ampérométrique.

1Instruments, équipements et réactifs

1.1 Réactifs et normes

Tableau 1. Liste des réactifs et normes

1.2 Matériaux de laboratoire et équipements auxiliaires

• 1.2.1 Balance d'analyse (0,1 mg à lire);
• 1.2.2 bain à eau thermostatique;
• 1.2.3 Centrifugeuse;
• 1.2.4 Filtres à membrane de polyéthersulfone aqueux (0,45 μm);
• 1.2.5 eau ultrapure;
• 1.2.6 dispositif de filtration sous vide;
• 1.2.7 cartouches de prétraitement à extraction en phase solide (SPE) RP;
• 1.2.8 Seringues à usage unique (20 ml, 5 ml).

2Métode expérimentale

2.1 Préparation de la solution

• 2.1.1 200 mmol/l de solution d'hydroxyde de sodium: pipette de 10,5 ml de 50% de NaOH, diluée avec de l'eau à 1000 ml et filtrée sous vide.
• 2.1.2 Solution mélangée de 75 mmol/l de NaOH et de 250 mmol/l d'acétate de sodium: peser avec précision 20,51 g d'acétate de sodium, le dissoudre dans de l'eau et le transférer dans une ampoule volumique de 1000 ml; avec précision la pipette 3.95 ml de 50% de NaOH, diluer à 1000 ml avec de l'eau ultrapure et filtrer sous vide.
• 2.1.3 Solution d'acide sulfosalicylique à 3%: peser 3,0 g d'acide sulfosalicylique, le dissoudre dans de l'eau et le diluer à 100 ml (préparer frais).
• 2.1.4 Solution de base standard mélangée: peser avec précision 5 mg chacun de 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tétraose et lacto-N-néotétraose (à la précision maximale de 0.1 mg), placer dans un flacon volumétrique de 10 ml, dissoudre dans de l'eau et diluer à la marque pour préparer un stock mélangé de 500 mg/l. Peser séparément 1 mg de difucosyllactose (à la précision de 0,1 mg),placer dans un flacon volumétrique de 10 ml, dissoudre et diluer à la marque pour préparer un stock de 100 mg/l.
• 2.1.5 Solution de travail standard mixte: pipettez avec précision la solution de base mixte (2.1.4) dans des flasques volumétriques et diluer avec de l'eau pour préparer des solutions mixtes de travail de 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT et DFL à 0.5, 2, 4, 6, 8 et 10 mg/l. Préparer frais avant utilisation.

2.2 Préparation des échantillons

On pèse un échantillon d'environ 2,0 g dans un petit bol, on le mélange soigneusement avec 50 ml d'eau tiède (environ 50 °C), on y ajoute 40 ml de solution à 3% d'acide sulfosalicylique,transférer et diluer à 100 ml dans une ampoule volumétrique, et sonicate pendant 10 min. Filtrez à travers du papier filtre ou une centrifugeuse (12.000 r/min, 15 min). Passez la solution d'échantillon à travers une cartouche RP SPE puis un filtre à membrane aqueuse de 0,45 μm;éliminer les 3 premiers ml et collecter l'éluat pour analyseAvant utilisation, conditionner la cartouche RP SPE avec 20 ml de méthanol suivi de 15 ml d'eau et équilibrer pendant 30 min.

2.3 Conditions expérimentales

2.3.1 Conditions de chromatographie ionique

3. Résultats

3.1 Portée linéaire

Une aliquote appropriée de chaque solution mixte standard de travail a été analysée, l'intervalle linéaire étant de 0,5 à 10 mg/l.les écarts entre les concentrations mesurées et les concentrations nominales étaient inférieurs à l'écart maximal admissible, les valeurs de R2 étaient supérieures à 0.999, et tous les composants ont montré une bonne linéarité.

Tableau 2. Plateaux linéaires des composés

Figure 1. Chromatogrammes d'étalonnage superposés des sept normes HMO

3.2 Résultats des essais d'échantillonnage

Les échantillons 1 et 2 ont été testés après dilution de 10 fois. La teneur de chacun des sept OMS a été calculée comme suit: X est la teneur de l'échantillon (mg/100g);c est la concentration dans la solution d'échantillon à partir de la courbe d'étalonnage (mg/L); V est le volume constant (mL); m est la masse de l'échantillon (g); f est le facteur de dilution. Les teneurs calculées (mg/100g) sont les suivantes:

Figure 2. Chromatogramme ionique de l'échantillon 1 dilué 10 fois

Figure 3. Chromatogramme ionique de l'échantillon 2 dilué 10 fois

Tableau 3. Résultats des essais par échantillonnage

3.3 Précision

La solution de travail au quatrième niveau d'étalonnage a été analysée en six injections consécutives dans les conditions de 2.3.1Le RSD des sept contenus HMO a été calculé pour évaluer la répétabilité.

3.3.1 Précision de répétabilité standard

Résultats des essais:

Figure 4. Chromatogrammes superposés d'injections réplicées indépendantes de la norme d'étalonnage S4

Tableau 4. Précision de répétabilité de la norme

3.4 Limites de détection et de quantification

LOD: les aliquotes de la solution standard ont été diluées en une solution mixte contenant 10 μg/L 3'-FL, 30 μg/L DFL, 30 μg/L 2'-FL, 22 μg/L LNnT, 67 μg/L LNT, 67 μg/L 6'-SL et 160 μg/L 3'-SL;20 échantillons parallèles ont été préparés et analysés.

LOQ: les aliquotes de la solution standard ont été diluées dans une solution mixte contenant 30 μg/L 3'-FL, 80 μg/L DFL, 90 μg/L 2'-FL, 65 μg/L LNnT, 200 μg/L LNT, 200 μg/L 6'-SL et 500 μg/L 3'-SL;six échantillons parallèles ont été préparés et analysés.

Les résultats des essais sont les suivants:

Tableau 5. Résultats S/N pour les LOD et LOQ des sept OMS

3.5 Spécificité

Des aliquotes (100 μl chacune) de solutions standard de glucose, de fructose, de saccharose et de maltose ont été ajoutées à un flacon volumétrique de 10 ml et diluées à la marque avec une solution de l'échantillon 2 diluée 67 fois.La solution a été analysée pour vérifier si ces sucres interfèrent avec les pics des sept HMOComme indiqué ci-dessous, les quatre sucres n'ont montré aucune interférence significative avec la détermination des sept OMS dans le lait en poudre.

Figure 5. Chromatogrammes superposés d'étalonnage S6, échantillon 2 et échantillon 2 ajoutés aux quatre normes de sucre

4Conclusion

Cette validation a utilisé le chromatographe ionique WAYEAL pour vérifier la méthode de détermination des OMS dans les denrées alimentaires.LNnT, LNT, 6'-SL et 3'-SL éluent tous dans un délai de 60 min; la sensibilité répond aux exigences des normes nationales; et les coefficients de corrélation linéaires sont tous supérieurs à 0.999. La répétabilité des normes et des échantillons est bonne. À l'exception des deux sialyllactoses, la LOD et la LOQ sont au niveau de μg/l. La méthode a une bonne spécificité, aucune impureté interférente n'a été trouvée,et répond globalement aux exigences de la norme.